LC-MS in der klinischen Diagnostik

Massenspektrometrie

LC-MS in der klinischen Diagnostik

In den vergangenen Ausgaben der European Hospital wurde wiederholt auf die Entwicklungen zur klinischen Anwendung Massenspektrometrie-basierter Methoden in der Patientenversorgung hingewiesen.

Bericht: Walter Depner

Hierbei wurden verschiedene Aspekte deutlich. Die Nutzung des LC-Triplequad-MS für das TDM kann heute als Standard betrachtet werden, obwohl auch die klassisch eingesetzten Immunoassays weiterhin praktikabel sind. Die Beschränkungen dieser Techniken wie Non-Spezifitäten und Matrixeinflüsse, haben jedoch unmittelbare Auswirkungen auf Therapieentscheidungen. Fehleinschätzungen haben fatale Folgen. Daher stellt sich die Frage, ob dies heute noch zu tolerieren ist.

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In Verbindung mit der Steroidanalytik sind die Unzulänglichkeiten der Ligandenassays aufgrund von Kreuzreaktivitäten bei einer Vielzahl von Strukturhomologen seit langem bekannt. In vielen Regionen stehen deshalb schon seit Jahren massenspektrometrie-basierte Verfahren für die breite Routine zur Verfügung oder haben die Ligandenassays abgelöst.

Historisch bedingt denken im klinischen Labor tätige Mediziner vielfach in Einzelparametern. Ausnahmen bilden die hämatologische Diagnostik (Blutbild), die Elektrophorese oder die Lymphozytendifferenzierung, bei denen Parameter-Profile zur Interpretation herangezogen werden. Durch massenspektrometrische Verfahren können Parameterprofile ohne großen zusätzlichen Aufwand generiert werden, was z.B. in der Steroidanalytik und in der Metabolomik schon genutzt wird. Hier wird ein weiteres Umdenken zu erfolgen haben. Prof. Ceglarek aus Leipzig hat bereits auf die Vorteile hingewiesen, nämlich kleinere Probenvolumina, simultane Analytik und das Fehlen von Kreuzreaktivitäten. Dr. Kromidas hat den Fortschritt von REIMS (Rapid Evaporative Ionization-MS) in der onkologischen Chirurgie hervorgehoben, denn damit erfährt der Chirurg in Echtzeit etwas über die Dignität des Gewebes.

Ein weiterer revolutionärer Fortschritt hat sich durch den Einsatz des MALDI-TOF-Fingerprinting in der Keimidentifikation ergeben, eine Technik die inzwischen aus dem Labor nicht mehr wegzudenken ist.

Technische Aspekte

Die Sensitivität und Robustheit aktueller LC-Tandem-MS-Systeme hat inzwischen einen Grad erreicht, der die robuste Messung vieler medizinisch relevanter Parameter erlaubt, wie z.B. Biogener Amine, Steroide, Vitamine und Metaboliten. Als Einschränkung ist das Fehlen von vollautomatisierten random-access-Systemen zu sehen, wie sie bei klinisch-chemischen oder Ligandenassay basierten Analyzern bekannt sind. Auch wenn die Dienstleistungslabors davon weniger betroffen sind als Krankenhauslabors gibt es verschiedene Ansätze, auch diese Lücke zu schließen. 

Zum einen stehen inzwischen speziell auf die LC/MS-Kopplung abgestimmte „Front Ends“ zur Verfügung, offene Systeme, die die inhaus-Entwicklung von Proben-weiser im Gegensatz zu batch-weiser Abarbeitung ermöglichen. Bei der stationären Patientenversorgung sind manche Parameter, z.B. TMD, möglicherweise 24/7 gewünscht, was sich auf solchen Systemen realisieren lässt. Auch erste vollautomatisierte Systeme sind auf den Markt gekommen, die allerdings als geschlossene Systeme nur die Verfahren zur Verfügung stellen, die der Hersteller für interessant hält und anbietet. Zusammen mit der Verfügbarkeit von Kit-Methoden öffnet sich damit auch für methodisch nicht versierte Anwender die Möglichkeit, MS-basierte Verfahren einzusetzen.

Aspekte wie die automatisierte Probenvorbereitung und LIMS-Anbindung hat Dr. Stimpfl aus Wien besonders betont. Diese Features sind bei kommerziellen, vollintegrierten Analyzern selbstverständlich, werden aber zunehmend auch bei Inhaus-Systemen eingeführt und bringen eine erhebliche Fehlerreduktion und Zeitersparnis gegenüber der manuellen Arbeitsweise mit sich. Der Vorteil eines vollintegrierten Systems ist, dass die Hersteller Einzelkomponenten optimal aufeinander abstimmen können, so dass platzsparende Systeme auch im Random access modus möglich sind. Denkbar sind solche Entwicklungen auch im Inhaus-Bereich. Welche Ausfallzeiten und MTBFs bei vollintegrierten Systemen anfallen werden, kann jetzt noch nicht abgesehen werden.

Fortschritte in der Entwicklung von Ionenquellen, wie z.B. die DRILL-Technik führen zu Steigerungen der Sensitivität um den Faktor 10. Die Kopplung mit ion mobility-separation eignet sich zur Unterdrückung von isobaren Interferenzen und bringt damit eine Verbesserung der Spezifität.

Die Verwendung der Immuno-Affinitäts-Aufreinigung im Rahmen der Probenvorbereitung zur LCMS soll eine Anreicherung eines Peptid-Targets bis zum Faktor 1000 ermöglichen. Damit könnte ein stabil-Isotopen markierter interner Standard eingesetzt werden, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Auch die Bestimmung von Enzymaktivitäten über die Messung des Substrates ist mittels LC-MS/MS sinnvoll möglich. Im Labor von Prof. Keevil in Manchester wird so die Renin-Aktivität routinemäßig mittels LC-MS/MS bestimmt.

Das breite Angebot an hochauflösenden Massenspektrometern ermöglicht die Nutzung zur Datenbanksuche und Identitätsbestätigung von Analyten sowie die Abtrennung von Interferenzen, wobei hier Kompromisse in der Sensitivität nötig sind.

Jetzige und zukünftige medizinische Aspekte

Die Arbeiten der letzten Jahrzehnte haben bewiesen, dass massenspektrometrische Methoden verglichen mit Ligandenassays nicht nur qualitativ besser, sondern auch routinefähig sind

Unsere eigenen Daten zeigen beispielsweise, dass Testosteron bei Frauen mit einem automatisierten Immunoassay in einem Bereich von – 80% bis zu +80% vom LC-MS/MS-Wert abweicht, wogegen die LCMS-Ergebnisse einen Gesamtfehler von nur wenigen Prozent aufweisen. Ähnlich ist die Datenlage für die Bestimmung von Vitamin D mit der LC-MS/MS im Vergleich zum Immunoassay. Die praktische Seite im Labor Wisplinghoff und in unserem eigenen Haus zeigt, dass die LC/MS in Großserien wie bei Vitamin D und Steroiden gut einsetzbar ist. Sie hat großes Potential zur Verbesserung der analytischen Qualität verglichen mit den kommerziellen Ligandenassays.

Im Rahmen der Therapiesteuerung für das Multiple Myelom ermöglicht der Einsatz der LC-MS/MS eine spezifische Detektion des Myelomproteins mit einer über 2000-mal höheren Sensitivität als die aktuell verwendete Immunfixationselektrophorese. Damit könnte auf eine Knochenmarksuntersuchung zum Follow-up verzichtet werden und eine frühere Erkennung einer minimal residual disease beziehungsweise eines Relapse wäre möglich. Assays für Tumormarker sind bekanntlich schlecht miteinander zu vergleichen und die Aussage dieser Parameter daher nur von begrenztem Nutzen. Möglicherweise ergeben sich neue Aspekte durch eine spezifischere Bestimmung dieser Antigene mittels LC-Tandem-MS.

Die Arbeiten der letzten Jahrzehnte haben bewiesen, dass massenspektrometrische Methoden verglichen mit Ligandenassays nicht nur qualitativ besser, sondern auch routinefähig sind. Dennoch sind diese neuen Methoden nicht überall in die tägliche Arbeit eingeflossen, selbst im Rahmen von Studien wird oft noch mit unterlegenen Methoden gearbeitet. Gründe dafür könnten sein, dass in der labormedizinischen Ausbildung die Testentwicklung kaum eine Rolle spielt. Oft fehlt auch das methodische Verständnis auf medizinischer Seite. In der Labormedizin stellen sich aber die Fragen.

Es ist die Verantwortung des Labormediziners, Analytik auf einem zeitgemäßen Niveau sicherzustellen. Diese Expertise kann nur von ihm kommen, da der ausschließlich klinisch tätige Arzt den Einfluss der verwendeten Methoden auf den diagnostischen Prozess nur bedingt einschätzen kann und ein nur methodisch tätiger Naturwissenschaftler nicht die medizinische Expertise mitbringt. Die breitere Entwicklung von Inhaus-Verfahren und die damit verbundene Expertise ermöglicht es, auch im ambulanten Bereich wissenschaftliche Fragestellungen zu erarbeiten, ein Bereich, der aktuell völlig vernachlässigt wird, aber einen großen Teil der Bevölkerung betrifft.

Wirtschaftliche Aspekte

Praktische Aspekte, wie Mitarbeiterqualifikation und technical skills zum Betrieb der Geräte werden unterschiedlich bewertet. Nach unseren Erfahrungen ist die Nutzung der LCMS in der Routine nach einer angemessenen Einarbeitung zuverlässig möglich. Die nötigen Kenntnisse zur Methodenentwicklung  wachsen natürlicherweise und stellen ein wertvolles Kapital eines Labors dar.

Bei kommerziellen vollautomatisierten Systemen ist zu beachten, dass hier zunächst Ertragsaspekte beim Hersteller treibend wirken. Es werden also die Parameter angeboten, von denen sich der Hersteller aufgrund des hohen Durchsatzes den größten Gewinn erhofft und nicht zwingend solche, die medizinisch am sinnvollsten sind. Natürlich werden kommerzielle vollintegrierte Systeme immer teurer sein, als die entsprechenden Inhaus-Verfahren. Für das Labor ergibt sich dadurch die (widersprüchliche) Situation, dass der Ertrag für hochvolumige und damit kosteneffektive Parameter an den Hersteller fließt, und teurere Spezialparameter ebenfalls teurer mit einer Inhaus-Methode mit niedrigen Probenzahlen erbracht werden müssen. Bei der generellen Nutzung von Inhaus-Tests kommt es hingegen zu einer vernünftigen Mischkalkulation mit Synergien und breiterer Nutzung der vorhandenen Expertise. Dieser Faktor erscheint gerade unter dem heutigen wirtschaftlichen Druck mit allseitigen Ertragserwartungen wichtig.

Generell gilt, dass die Investitionskosten für die LC-MS/MS substanziell sind. Die Folgekosten für Testentwicklung und Betrieb sind dafür aber gering. Für eine HPLC-Säule, die mit 700€ in der Anschaffung teuer erscheint, ergibt sich z.B. bei einer Standzeit von 20.000 Injektionen ein Preis von 0,035€ pro Messung. Natürlich ist auch der Aufbau von Expertise nicht kostenlos, ist aber eine nachhaltige Investition. In der heutigen kompetitiven Situation wird dem Labor dadurch die Möglichkeit gegeben, flexibel auf veränderte Anforderungen zu reagieren und gleichzeitig höchstes analytisches Niveau zu bieten.

Quintessenz

Kostenträger müssen erkennen, dass eine qualitativ hochwertige Analytik die preiswertere Alternative zu vordergründig billigen Testmethoden darstellt

Nach wie vor wird die Verwendung der LC-MS/MS in der klinischen Routine als teure Nischenmethode für hochspezialisierte Analytik betrachtet. Dies ist nicht mehr zeitgemäß, denn es stehen viele robuste und zuverlässige Optionen zur Nutzung zur Verfügung. Wünschenswert für die Labormedizin als Fach wäre eine stärkere Betonung  von  Kenntnissen in der Methodenentwicklung, auch für anspruchsvollere Verfahren wie die Massenspektrometrie, die aktuell noch oft von Chemikern betrieben wird. Das methodische Arbeiten würde unter dem Aspekt des klinischen Hintergrundes noch weit mehr diagnostische Optionen eröffnen, als dies derzeit praktiziert wird. Kostenträger müssen erkennen, dass eine qualitativ hochwertige Analytik die preiswertere Alternative zu vordergründig billigen Testmethoden darstellt. Dies kann unter Berücksichtigung mediko-legaler Implikationen an Bedeutung gewinnen.

14.01.2019

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