Molekulare Bildgebung von Karzinomen
Chirurgen an der Charité haben in kolorektalem Tumorgewebe eine spezifische Anhäufung von Protoporphyrin-IX (PpIX), einem rot-fluoreszierenden Vorläufermolekül des Häms beobachtet. Wir konnten zeigen, dass diese Anhäufung von PpIX darauf zurückzuführen ist, dass das Enzym, das PpIX normalerweise in Häm überführt, die sogenannte Ferrochelatase, im Gewebe von Karzinomen des Verdauungstraktes nur in geringen Mengen vorhanden ist.
Inzwischen ist die Forschungsgruppe in der Lage diesen Effekt durch gentherapeutische Eingriffe mittels RNA-Interferenz gezielt und verstärkt auszulösen. Die dadurch erreichte intrazelluläre Anhäufung von PpIX führt zu einer deutlichen roten Fluoreszenz in den so behandelten Zellen. Diese Technik kann für die molekulare Bildgebung von Karzinomen und, bedingt durch die Allgegenwärtigkeit des Häm-Stoffwechsels, möglicherweise auch zur direkten Anfärbung anderer Gewebe oder Zellen eingesetzt werden.
Ziel des Forschungsprojektes ist es eine diagnostische Anwendung dieser neuartigen Methodik - die Identifikation und Charakterisierung zirkulierender Tumor(stamm)zellen im Blut - zu untersuchen. Des weiteren soll die Eignung dieser Methodik für die photodynamische Therapie untersucht werden. Diese Fragestellung zielt auf eine Verbesserung der Spezifität und der Effektivität der bereits etablierten photodynamischen Krebstherapie ab.
Bereits vor einigen Jahren wurde von Chirurgen unserer Klinik an der Charité Campus Berlin-Buch beobachtet, dass kolorektales Tumorgewebe eine spezifische rote Fluoreszenz zeigt (Abb. 1). Wir konnten zeigen , dass diese Fluoreszenz auf die Anhäufung von Protoporphyrin-IX (PpIX), eines Vorläufers des Häms, im Tumorgewebe zurückzuführen ist. Häm und Proteine, die Häm enthalten, sind in nahezu jeder Zelle aller Eukaryonten zu finden. Bekannt ist vor allem die Funktion des Häms im Hämoglobin der roten Blutzellen für den Sauerstofftransport. Darüber hinaus benötigen alle kernhaltigen menschlichen Zellen Häm, da es für den Energiemetabolismus der Zelle notwendig ist.
Die Ursache der erhöhten Bildung von PpIX im Tumorgewebe war nicht bekannt. Daher machten wir es uns zur Aufgabe nach den Gründen für die PpIX-Anhäufung in Tumorgewebe zu suchen. Es lag nahe sich zuerst die Enzyme der Hämsynthese genauer anzuschauen und deren Aktivität zu bestimmen. Dabei haben uns vor allem die Aminolävulinsäure-Synthase ALA-S1 und die Porphobilinogen-Deaminase PBG-D interessiert. Eine Überfunktion dieser Enzyme würde zu einer erhöhten Produktion von PpIX führen. Dagegen würde eine Minderfunktion der Enzyme Ferrochelatase und der Häm-Oxygenase zu einer Anhäufung von PpIX führen, da diese für den Abbau verantwortlich sind. Wir haben sowohl die Aktivität der Enzyme, wie ihre Transkription d.h. die Bildung der spezifischen Boten-RNA untersucht. Sowohl in Magen- Kolon- und Rektumkarzinomen fanden wir vor allem eine deutliche Minderexpression des Enzyms Ferrochelatase, das den letzten Schritt der Hämsynthese, die Umwandlung von PpIX zu Häm katalysiert. Um die Rolle der Ferrochelatase für die PpIX-Akkumulation besser zu verstehen, wurde in verschiedenen Tumorzellen experimentell die Bildung der Ferrochelatase Boten-RNA mittels der RNAi-Technik spezifisch blockiert. Die dadurch erreichte Blockade der Ferrochelatase führte zu einem Anstieg der PpIX-Konzentration und der spezifischen Fluoreszenz in den Zellen um das 20-fache. Wurde außerdem eine geringe Menge an Aminolävulinsäure (ALA), einem Vorläufer des PpIX, zum Kulturmedium zugegeben, konnte die PpIX-Konzentration sogar um mehr als das 50-fache gegenüber einer Gabe von ALA allein gesteigert werden. Der Anstieg der "roten" Fluoreszenz des PpIX in den Zellen wurde direkt mittels der Zwei-Photonenmikroskopie nachgewiesen (Abb. 2). In laufenden Experimenten versuchen wir nun diesen Effekt der in-vitro beobachteten Ferrochelatase-Blockade auch in-vivo zu nutzen. Dazu wurden humane Karzinome auf so genannte Nacktmäuse transplantiert und die Bildung der Ferrochelatase in diesen Tumoren mittels der RNAi-Technik blockiert. Um dies zu erreichen wurde das blockierende Agenz, so genannte siRNA-Oligonukleotide in kleine Lipid(Fett)tröpfchen verpackt und dann in das Tumorgewebe eingeschleust. In den Tumoren der xenotransplantierten Nacktmäuse konnte durch diese siRNA-Gabe ein deutlicher Anstieg der Fluoreszenz induziert werden (Abb. 3).
Insgesamt zeigen die bisherigen Ergebnisse, dass das Ausschalten der Ferrochelatase zur Anhäufung von fluoreszentem PpIX in den behandelten Zellen führt. Diese Technik kann für die molekulare Bildgebung von Karzinomen und, bedingt durch die Omnipräzenz des Häm-Stoffwechsels, auch von anderen Geweben oder Zellen eingesetzt werden. Wir haben zum ersten Mal siRNA für ein solches Imaging eingesetzt. Diese Methode hat wesentliche Vorteile, da das aktive Reagenz nicht in den Zellkern transportiert werden muss, sondern sein Ziel im Zytoplasma findet, und da keine relevante Toxizität zu erwarten ist, weil die Fluoreszenz nicht durch Zugabe einer fluoreszierenden Substanz sondern durch Modifikation eines endogenen Stoffwechselwegs, der Hämsynthese, erzielt wird.
Diese neuartige Methode bietet den Zugang zu neuen diagnostischen und therapeutischen Ansätzen bis hin zu strategischen Fragen der Grundlagenforschung. Klinische Anwendungen der PpIX-Fluoreszenz könnten von einem verbesserten Nachweis von zirkulierenden Tumor-Zellen zu einer besseren Definition von chirurgischen Rändern, Präkanzerosen und frühen Tumoren reichen. Die induzierte Anhäufung von Protoporphyrin-IX könnte auch für therapeutische Anwendungen einsetzbar sein, um über zusätzliche Laserbehandlung die selektive Zerstörung von siRNA-transfizierten Zellen zu erreichen.
16.10.2009
